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      熒光定量PCR技術常用的兩種分析方法

      發布時間:2021-12-08

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         熒光定量PCR是分子生物學實驗手段,也是檢驗科常用的方法。它通過熒光染料或熒光標記的具有特異性的探針,對PCR產物進行標記跟蹤,可以實時在線監控反應過程,結合相應的軟件可以對產物進行分析,計算待測樣品模板的初始濃度,也被稱為實時熒光定量pcr。
        它是在PCR定性技術基礎上發展起來的核酸定量技術。該技術不僅實現了對DNA模板的定量,而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現多重反應、自動化程度高、無污染性、具實時性和準確性等特點,目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫學研究等領域。在該技術中,有一個很重要的概念是Ct值。C代表Cycle, t代表threshold, Ct值的含義是:每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。研究表明,每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系,起始拷貝數越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可做出標準曲線,其中橫坐標代表起始拷貝數的對數,縱坐標代表Ct值。因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
        熒光定量pcr常用的兩種方法分別為:熒光染料摻入法和探針法
        1、熒光染料摻入法
        熒光染料摻入法原理是:在PCR反應體系中,加入過量熒光染料,熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后,發射熒光信號,而不摻入鏈中的染料分子不會發射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
        2、探針法
        探針法熒光定量pcr原理是:PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成同步。
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